שיטות מחקר ללא בעלי-חיים/ תמיר לוסקי
חדשות תקופתיות על חלופות לניסויים בבע"ח, מתוך הגליונות האחרונים של
ALTEX ו- ATLA: כתבי העת המובילים בעולם לחלופות לניסויים בבע"ח.
Vedani et al., ALTEX Vol 22;3:126-134
קיטים וירטואליים לחיזוי השפעות פוגעניות של תרופות וכימיקלים
שיטות ממוחשבות מתוחכמות הולכות ותופסות תאוצה כאמצעי חשוב לחיזוי השפעה של חומרים שונים על גוף אנושי חי ושלם. במערכות מסוג זה, המכונות מבדקי "in silico", נערך שימוש במודלים ממוחשבים של קולטנים - מולקולות חלבון מורכבות המשחקות תפקיד מפתח במטאבוליזם של תרופות ושל התגובות הנערכות בהשפעתן, על מנת לנסות לנבא את השפעותיהם של חומרים אלו על הגוף, לאחר חילוף חומרים.
קבוצת מחקר מבזל, שוויץ, פיתחה לאחרונה מערכת מבדק מטיפוס QSAR (יחסי מבנה-פעילות מדידים) המדמה תגובות של חומרים שונים עם קולטני אציל הידרוקרבון, אנדרוגן ואסטרוגן (לבדיקת הפרעה למערכת ההורמונלית), ציטוֹכרוֹם P450 3A4 (מהקולטנים החשובים ביותר בהתמרות מטאבוליות של תרופות) וקולטן התירוֹאיד.
הקבוצה בדקה 430 חומרים ומצאה התאמה גבוהה בין התוצאות שניבא המודל לתוצאות האמיתיות שהתקבלו ותועדו במערכת חיה. הקבוצה הקימה בעקבות התוצאות המעודדות את 'מעבדת האינטרנט לזיהוי ממוחשב של תופעות לוואי הנגרמות ע"י תרופות וכימיקלים'. כדי לפתח את המערכת הלאה, הקבוצה מוכנה להציע את שירותי הבדיקה של המעבדה הממוחשבת בחינם למוסדות אקדמיים וארגונים ללא מטרת רווח.
לפי המאמר, ניתן לכל הפחות לצמצם בצורה משמעותית את השימוש בבע"ח באמצעות מערכת זו. לדוגמא, ניתן לבדוק באמצעות המערכת הממוחשבת את השפעתם של חומרים חדשים שמשוערת להם השפעה טיפולית, עוד לפני שמתחיל הייצור הממשי שלהם ולמנוע ייצור והמשך בדיקה של חומרים המתגלים כמסוכנים.
ישנן שתי שגיאות אפשריות שמערכת בדיקה יכולה לבצע בהקשר זה. במקרה של טעות מהסוג הראשון, המכונה "תשובה שלילית שקרית" (false-negative), חומר בטוח עלול להסתמן כמסוכן במבדק. בטעות מסוג "תשובה חיובית שקרית" (false-positive) חומר מסוכן עלול להסתמן כבטוח. עד כה, המערכת השוויצרית לא יצרה תשובות חיוביות שקריות.
חשיבותם של מערכות מסוג זה זכתה לאחרונה לאישור והכרה מצד הארגון לפיתוח ושת"פ כלכלי (OECD) ושל הסוכנות להגנה סביבתית בדנמרק.
Lindl et al., ATLA 33;6:591-601
מבדק מבחנה חדש המבוסס על מעבר זרם חשמלי, מאפשר הערכה מדויקת של רעילות תרופות וכימיקלים
תאים חיים מוקפים במעטפת שוּמנית המאפשרת מעבר בררני של חומרים פנימה והחוצה מן התא. בנוסף, מעטפת זו, המכונה ממברנת התא, משמשת כחיץ חשמלי יעיל. תא חי מתחזק את הממברנה ושומר על שלמותה, בעוד בתאים מתים הממברנה מתפרקת במהרה. לפיכך, כימיקלים רעילים הגורמים לתמותת תאים, פוגעים במישרין או בעקיפין בשלמות הממברנה. שיטות רבות המבוססות על בדיקת שלמות ממברנת התא וממברנות פנימיות בתוך התא, מאפשרות כּימוּת של תמותת התאים (ולפיכך רעילות של כימיקלים הגורמים לתמותת תאים). שיטות קיימות רבות מבוססות על ספיגת חומרים החודרים באופן ספציפי לתאים מתים או חיים בלבד ועל אפיון מבוסס-צבע של תמותת תאים. בין שיטות אלו נכללות שיטת NRU, MTT ו- TB. בשתי השיטות הראשונות (NRU ו- MTT), חומר צבע חודר ומתמקם בתאים חיים בלבד וצובע אותם בבירור, בעוד תאים מתים נשארים שקופים. בשיטה השלישית (TB), תאים חיים מונעים את חדירת חומר הצבע ולפיכך נשארים שקופים, בעוד תאים מתים נצבעים בכחול. קבוצת מחקר מגרמניה בדקה שיטה חדשה, המבוססת על בדיקת יכולת הבידוד החשמלי של תאים בתרבית, כמדד לחיוניותם (ולהשפעה השלילית של תרופות וכימיקלים עליהם). שיטה זו, המכונה electric current exclusion (או ECE), מסוגלת לאחר כיול, לספק מידע רב, הכולל את ריכוז התאים בתרבית, נפח התאים, חיוניתם ורמת ההתקבצות שלהם, תוך 20 שניות בלבד. השיטה מסוגלת לכמת בדיוק רב את מספר התאים החיים והמתים בתרבית ולפיכך לספק מדד כמותי להשפעה השלילית של כימיקל על התאים.
למרבה הצער, הגופים הרגולטוריים באירופה וארה"ב (שסביב הקווים המנחים שלהם נבנה המחקר) מצפים משיטות מסוג זה לספק תוצאות מקבילות לתוצאות מניסויים מקבילים בבע"ח, במקום שיספקו תוצאות התואמות את המקרה הידוע בבני-אדם. לפיכך, השיטה נבדקה ע"י קבוצת המחקר בתאי עכבר, משורת-התאים L-929. שורת-תאים (בלעז cell line) מייצגת תאים סרטניים הגדלים ללא הפסקה ולפיכך מספקים מאגר בלתי-נדלה (בהמצא חומרי מזון) של תאים למחקר. ישנן שורות תאים רבות המוכרות ומשמשות למחקר ביורפואי, כולל מספר גדול של שורות תאים הוּמאניים (מבני-אדם).
לפיכך, לא היה צורך בהמתת עכברים כדי לספק את התאים לתרבית שבנדון, אולם בכל זאת אירוני שנבחרה שורת-תאים מעכבר כאשר נגישות שורות-תאים מבני-אדם.
בניסוי המתואר במאמר, נבדקו 50 כימיקלים בעלי רעילות ידועה, בארבעת השיטות מבוססות הצבע שתוארו לעיל ובשיטה החדשה. התוצאות מהמבדקים השונים הושוו לתוצאות הידועות שהתקבלו מניסויים בבע"ח. כל בדיקה נערכה מספר פעמים, כדי לבדוק אם התוצאות חוזרות על עצמן בעקביות. שיטת ה- ECE החדשה התגלתה בעקביות כרגישה ביותר וסיפקה תוצאות קרובות מאוד לתוצאות הידועות. גם שלושת השיטות האחרות שצוינו סיפקו בעקביות תוצאות מדויקות וקרובות לתוצאות הידועות. יתרון בולט של ECE על פני שיטות אחרות, כולל בדיקת רעילות בבע"ח, הוא שניתן באופן מיידי לאגור את התוצאות בצורה אלקטרונית ולנתח אותם בקלות. בנוסף, ניתן בשיטה זו לעקוב אחר השינויים במצב התרבית וחיוניות התאים בצורה רציפה לאורך זמן ולא רק בצורה נקודתית ובדידה. לפי הכותבים, מעקב לאורך זמן אפשרי גם בשיטות האחרות, אך הוא יקר ומסובך בהרבה.
לסיכום, שיטה זו מדויקת ויעילה לבדיקת רעילות בתרבית תאים וההתאמה הגבוהה שלה לתוצאות הידועות מציבות אותה כחלופה יעילה לשימוש בבע"ח. ניתן להיעזר בשיטה זו גם בתאים מבני-אדם, מה שצפוי להגביר עוד יותר את מהימנותה ככלי חיזוי ומודל לבני-אדם.
ATLA 33;6:557 (מתוך "News & Views")
האיחוד האירופאי משחרר הצהרה חדשה לגבי ניסויים בבע"ח
בכנס "אירופה פונה לחלופות", שהתרחש בבריסל ב- 7 בנובמבר 2005, האיחוד האירופאי והתעשייה יצרו שותפות שמטרתה קידום חלופות לניסויים בבע"ח. הצהרת 3 ה- R-ים הזו (הפחתה, מזעור סבל והחלפה של בע"ח במעבדות) יוצרת תשתית שתאפשר שיתוף פעולה בין התעשיה והשירותים הרלוונטיים של האיחוד האירופאי. במהלך 2006, יוקם צוות שיפתח תוכנית לפעילויות לטווח הקצר, הבינוני והארוך. בעיות ומחסומים המונעים התקדמות יזוהו ופתרונות יוצעו, כדי להבטיח את הפיתוח, האישור והקבלה הרגולטורית של שיטות חלופיות. יכללו הצעות מעשיות שיאפשרו:
- מיפוי של פעילויות המחקר והאסטרטגיה הנוכחיים.
- קידום שת"פ בין חוקרים, על מנת לחזק ולהגדיל את היקף הפעילות הנוכחית בין השותפים והקבוצות השונות.
- פיתוח גישות מחקר חלופיות, כולל אסטרטגיות בדיקה חכמות.
- התייחסות וטיפול בבעיות הפרקטיות הכרוכות בתהליך האישור של חלופות, תוך שימוש בידע קיים.
- הקמת מנגנונים פרקטיים שיקדמו את הקבלה הרגולטורית של גישות חלופיות.
- הגברת הדיאלוג בין הקבוצות השונות הנוגעות בנושא החלופות, כולל התעשיה, האקדמיה, גופים רגולטוריים וארגונים להגנה על בע"ח.
- קידום חדשנות במחקר העוסק בחלופות.
תוכנית הפעולה תיבדק על בסיס קבוע ותעודכן תקופתית, ודו"ח יפורסם על בסיס שנתי ויובא לידיעת מועצת אירופה, הפרלמנט האירופאי וקבוצות רלוונטיות נוספות.
Cardoso et al., ALTEX Vol 22;3:152-156
מצע גידול לתאים בתרבית - ללא רכיבים מבע"ח
ארגונים רגולטוריים באירופה וארה"ב מעודדים בשנים האחרונות הפחתה או החלפה מלאה של בע"ח ומוצרים המכילים רכיבים מבע"ח בתהליכי ייצור ביולוגיים. אחת הדוגמאות הנפוצות הן שימוש במצעי גידול על בסיס דם מעגלים או עוברי תרנגולות לצורך גידול תאים בתרביות רקמה.
קבוצת מחקר בראשות טרזה קרדוסו מברזיל, הראתה כי ניתן לגדל תאים בתרבית, על בסיס מצע ללא סרוּם או חלבונים מבע"ח. התאים גדלו בצורה תקינה ואף היה ניתן להדביק אותם בוירוס דלקת הסימפונות (IBV) ולגדל כמויות גדולות של הוירוס בתאים אלה.
Zechmeister et al., ALTEX Vol 22;3:186-195
מבדק מבחנה יעיל לבדיקת נוכחות הרעלן הניורוטוקסי BoNt C1 במקום מבדק בעכברים
החיידק Clostridium botulinum נפוץ באזורים לחים ומשחרר בתנאים מסוימים רעלן הפוגע במערכת העצבים. ציפורים נודדות רגישות במיוחד לרעלן זה ולכן נערכות בדיקות תקופתיות באזורי מטרה ידועים. השיטה המסורתית לבדיקת נוכחות הרעלן היא באמצעות עכברים, להם מוזרקות דגימות מהשטח עם או ללא הדגרה קודמת של הדגימות במעבדה. קבוצת מחקר אוסטרית בחנה כחלופה שימוש בשיטת ELISA לבדיקת נוכחות הרעלן (על בסיס קשירה של נוגדנים), יחד עם PCR (שיטה להגברה מהירה של מקטעי דנ"א) המשמש לאיתור נוכחות של חיידקי C. botulinum, לאחר הדגרה של דגימות מהאתרים החשודים, במצע העשרה. החוקרים מצאו שהיתה התאמה גבוהה בין התוצאות שהתקבלו במבדקים החלופיים לבין מבדק העכבר המסורתי. המבדק החלופי היה אף רגיש יותר מהמבדק המסורתי וניתן בעזרתו לאתר גם אתרים בעלי פוטנציאל גבוהה יותר להופעת רעלן פעיל, בנוסף לאתרים בהם כבר ישנה התפרצות ונוכחות גבוהה של החיידקים והרעלן.
Kohling et al., ATLA 33;6:579-589
שימוש במבדקי מבחנה לבדיקת רעילות למערכת העצבים
תאי עצב תקינים מאופיינים בהתנהגות חשמלית טיפוסית המתבטאת בגלים של מתח חשמלי. רעלים הפוגעים במערכת העצבים לרוב גורמים לשינויים נראים לעין ולהרס תאים, אך גם לשינויים בהתנהגות תאי העצב ופעילותם החשמלית. קבוצת מחקר מגרמניה בדקה שינויים בהתנהגות החשמלית של חתכי מוח מאזור ההיפוקמפוס מחולדה ומאדם, כשיטת מבדק של רעילות עצבית וכחלופה לשיטות מסורתיות המבוססת על שינויים נראים לעין ברקמת מוח, של בע"ח שנחשפו לחומרים אלה. לצורך כך, נעשו מדידות באמצעות מערך מיקרו-אקלטרודות ישירות לחתכי המוח, המאפשר מדידה ממספר אתרים בו-זמנית.
החוקרים גילו כי רעלנים גורמים לשינוים מדידים וברורים בהתנהגות החשמלית של תאי העצב שנבדקו. התנהגות החתכים מהחולדה ומהאדם היתה דומה, ובשני המקרים התוצאות היו אנלוגית לתוצאות המתקבלות בשיטות מבדק אחרות לרעילות עצבית (המבוססות בד"כ על שינויים נראים לעין במבנה ושלמות התאים). לפיכך, שיטה זו, בה ניתן להיעזר ברקמות מוח אנושיות (שממילא נזרקות לפח בניתוחי ביופסיה), יכולה לשמש לבדיקה מהימנה של רעילות למערכת העצבים, ללא בע"ח.
Ohmori et al., ATLA 33;6:619-639
מחקר רב-מעבדתי למבדק תאים במבחנה ככלי לחיזוי פעילות מסרטנת של כימיקלים
נהוג לחלק את החומרים הפעילים בתהליך יצירת סרטן לשתי קטגוריות: מתחילים (initiators) ומקדמים (promoters). חומרים מהסוג הראשון לרוב גורמים לפגיעה בחומר הגנטי בתא (תופעה המכונה "גנוטוקסיות"). קיימים מבדקים יעילים רבים לבדיקה של חומרים גנוטוקסיים במבחנה, שאושרו ע"י גופים רגולטוריים. עד כה, לא אושרו מבדקי מבחנה לבדיקת חומרים מהסוג השני (חומרים שאינם גנוטוקסיים), למרות שקיימות לצורך כך מספר שיטות מבחנה.
מבחן המבוסס על שורת תאים אנושיים מסוג Bhas 42, מאפשר בדיקה של חומרים משני הסוגים, בתרבית. מטרת המחקר היתה לבדוק בצורה מקיפה ומעמיקה את היישומיות והמהימנות של השיטה בתנאים שונים, כדי להגביר את המודעות אליה במידה ותימצא כיעילה. השתתפו במחקר 14 מעבדות הממוקמות במוסדות אקדמיים ובתי-חולים ברחבי יפן. ראשית, כל מעבדה ערכה מבדק עם שני חומרים מסרטנים ידועים, כדי לוודא כי הם יכולים לקבל תוצאות חיוביות במבדק זה. לאחר מכן, נבדקו 12 חומרים ידועים אחרים, כשכל כימיקל נבדק בארבע מעבדות. בסיום המחקר, התגלה כי מערכת זו רגישה ואכן מאפשרת בדיקה של חומרים גורמי סרטן. עבור 8 מהכימיקלים, כל ארבעת המעבדות שבדקו כל אחד מחומרים אלה הניבה תוצאות עקביות ותואמות לאחרות. התוצאות היו עקביות גם עבור ארבעת החומרים הנותרים, אם כי מעבדה אחת קיבלה תוצאות בלתי עקביות עבור שניים מתוכם. כלומר: בסה"כ התוצאות היו עקביות, מה שמעיד על מהימנות גבוהה של השיטה. מן התוצאות שהתקבלו, הִסתמן מידע חדש לגבי מנגנוני הפעולה של החומרים שנבדקו והדרך בה הם גורמים לסרטן. כמו כן, המידע שנאסף רמז כיצד ניתן לשפר עוד יותר את השיטה.
Langley et al., ATLA 33;6:641-648
הזדמנויות להחלפת שימוש בבע"ח בחקר אלח-דם
אלח-דם (sepsis) הוא תופעה בה הדבקה חמורה גורמת להופעת מחוללי מחלה בדם. יחד עם הופעתם, ישנה תגובה דלקתית מוגברת ובלתי-מבוקרת. אלח-דם חמור עלול לגרום לכשל אברים וסיבוכים נוספים העלולים להחמיר עד כדי מוות, בעיקר באנשים בגיל מבוגר. בע"ח משמשים מזה מעל 20 שנה בחקר התופעה, אך ההתקדמות בהבנת מנגנוניה מועטה, עקב התאמה מועטה של המודלים החייתיים למצב האנושי. לפי מחקרים שנערכו בנושא, מספר גדול של טיפולים שהצליחו בבע"ח נכשלו בבני-אדם. לצורך דיון באמצעי מחקר מודרניים בתחום זה, נערכה סדנה בהשתתפות מספר רב של קבוצות מחקר בריטות, שדנו בשיטות מבחנה, הדמיות מחשב ומחקר קליני עם בני-אדם בהשוואה למחקר בבע"ח.
עבודה קלינית עם בני-אדם, למשל, מאפשרת זיהוי של גורמים גנטיים המעורבים ברגישות לאלח-דם; באמצעות עבודה עם תאים אנושיים בתרבית והדמיות ממוחשבות, ניתן לאסוף מידע רב ורלוונטי לגבי המנגנונים הבסיסיים המעורבים בתהליך. לפי החוקרים שהשתתפו בסדנה, ניתן להיעזר בשיטות אלו כדי לבצע מחקר מתקדם בחקר תופעת אלח-הדם, וכי יש לפתח את הכלים הקיימים הלאה ולספק שיטות חדשות כדי לנוע הלאה מהיאחזות והיתלות בניסויים בבע"ח. שכן כאמור, אלו אינם מהווים מודל מהימן של התופעה האנושית. יתרה מכך, אחד הכלים הרלוונטיים והיעילים ביותר, מחקר קליני, סובל מחוסר בתקציב וכח-אדם, בעוד מחקר פחות רלוונטי ויעיל עם בע"ח מתוקצב פי כמה.
